Խմբագրվել է Փիթեր Սարնոուի կողմից, Սթենֆորդի համալսարանի բժշկության դպրոց, Սթենֆորդի համալսարան, Կալիֆորնիա, հաստատվել է 2020 թվականի դեկտեմբերի 25-ին (վերանայվել է 2020 թվականի հոկտեմբերի 25-ին)
Մենք զեկուցում ենք ենթամիավորների միջև փոխազդեցությունը կորոնավիրուսների վերարտադրման համալիրների վերարտադրության մեջ, որոնք էական նշանակություն ունեն վերարտադրության և էվոլյուցիոն պահպանման համար:Մենք ապացույցներ ներկայացրեցինք, որ nsp12-ի հետ կապված NiRAN տիրույթն ունի նուկլեոզիդ մոնոֆոսֆատ (NMP) տրանսֆերազային ակտիվություն տրանս-ում և որպես թիրախ բացահայտեցինք nsp9 (ՌՆԹ կապող սպիտակուց):NiRAN-ը կատալիզացնում է NMP մասի կովալենտային կցումը պահպանված nsp9 ամինային վերջնակետին մի ռեակցիայի մեջ, որը հիմնված է Mn2+ իոնների և հարակից պահպանված Asn մնացորդների վրա:Պարզվել է, որ NiRAN-ի ակտիվությունը և nsp9 NMPylation-ը կարևոր են կորոնավիրուսի վերարտադրության համար:Տվյալները թույլ են տալիս մեզ կապել տեղադրված վիրուսի ֆերմենտի մարկերի այս գործունեությունը նախորդ դիտարկումների հետ այն վարկածի հետ, որ ՌՆԹ-ի սինթեզի մեկնարկը ՌՆԹ վիրուսների դասում ֆունկցիոնալ և էվոլյուցիոն առումով համահունչ է:
Nidovirales-ի (Coronaviridae, Arterioviridae և 12 այլ ընտանիքներ) ՌՆԹ-կախյալ ՌՆԹ պոլիմերազը (RdRps) կապված է ամինոտերմինալ (N-տերմինալ) տիրույթի հետ պոլիպրոտեինից ազատված ոչ կառուցվածքային սպիտակուցում (nsp), որը կոչվում է NiRAN: 1ab-ը կազմված է վիրուսային հիմնական պրոթեզից (Mpro):Նախկինում զարկերակային NiRAN-RdRp nsp վիրուսի սեփական GMPylation/UMPylation գործունեությունը հաղորդվել էր, և առաջարկվում էր ստեղծել անցողիկ նուկլեոզիդ մոնոֆոսֆատի (NMP) փոխանցման համար (ներկայումս անհայտ) վիրուս և/կամ բջիջների բիոպոլիմերացման իրեր:Այստեղ մենք ցույց ենք տալիս, որ կորոնավիրուսը (Մարդու Coronavirus [HCoV]-229E և ծանր սուր շնչառական համախտանիշ Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) ունի Mn2+-ից կախված NMPylation ակտիվություն, որը ստացվում է nsp9-ից՝ Mpro միջնորդավորված nsp9-ի ձևավորման միջոցով: N-տերմինալի եզրային nsps-ը պրոտեոլիտիկ կերպով ազատվում է, ֆոսֆորամիդատը կապված է առաջնային ամինի հետ (N3825) nsp9-ի N-տերմինալում:Ուրիդին տրիֆոսֆատը նախընտրելի նուկլեոտիդն է այս ռեակցիայում, սակայն ադենոզին տրիֆոսֆատը, գուանոզին տրիֆոսֆատը և ցիտիդին տրիֆոսֆատը նույնպես հարմար համահունչ սուբստրատներ են:Մուտացիայի ուսումնասիրությունները՝ օգտագործելով ռեկոմբինանտ կորոնավիրուսային nsp9 և nsp12 սպիտակուցներ և գենետիկորեն մշակված HCoV-229E մուտանտներ, որոշեցին մնացորդները, որոնք անհրաժեշտ են NiRAN-ով միջնորդավորված nsp9 NMPylation-ի և վիրուսի վերարտադրության համար բջջային մշակույթում:Տվյալները հաստատեցին NiRAN-ի ակտիվ տեղամասի մնացորդների կանխատեսումը և որոշեցին nsp9 N3826 մնացորդների կարևոր դերը nsp9 NMPylation-ի և վիրուսի վերարտադրության մեջ in vitro:Այս մնացորդը պահպանված NNE տերմինալային եռապեպտիդային հաջորդականության մի մասն է և ապացուցվել է, որ nsp9-ի և նրա հոմոլոգների միակ անփոփոխ մնացորդն է կորոնավիրուսների ընտանիքում:Այս ուսումնասիրությունը ամուր հիմք է ստեղծում այլ ներդիր վիրուսների NMPylation գործունեության ֆունկցիոնալ ուսումնասիրության համար և առաջարկում է հակավիրուսային դեղամիջոցների զարգացման հնարավոր թիրախներ:
Nidovirales դրական շղթա ունեցող ՌՆԹ վիրուսը վարակում է մի շարք ողնաշարավորների և անողնաշարավորների (1, 2):Պատվերը ներկայումս ներառում է 14 ընտանիք (3), որոնցից Կորոնավիրուսի ընտանիքը լայնորեն ուսումնասիրվել է վերջին 20 տարիների ընթացքում։Այն ժամանակ կենդանիների հյուրընկալներից ի հայտ եկան երեք կենդանաբանական կորոնավիրուսներ և առաջացրին մարդկանց մոտ ծանր շնչառական վարակների լայնածավալ բռնկումներ։Այդ թվում՝ սուր սուր վարակիչ հիվանդությունների հետևանքով առաջացած մշտական պանդեմիաները։Շնչառական համախտանիշ Կորոնավիրուս 2 (SARS-CoV-2) (4ââ7).Նիդովիրուսները ունեն ընդհանուր գենոմային կազմակերպություն, և մեմբրանային կապակցված վերարտադրման-տրանսկրիպցիոն համալիրի (RTC) ենթամիավորը կոդավորված է 5-?²-տերմինալ երկու երրորդում և վիրուսի մասնիկի հիմնական կառուցվածքային ստորաբաժանումում, ինչպես նաև որոշ պարագաներում: .Սպիտակուցներ, որոնք կոդավորված են գենոմի 3/2 վերջի երրորդում (1):Բացառությամբ պլանարյան վիրուսների մեկ ընտանիքի (Monoviridae) (8), բոլոր ներդիր վիրուսները կոդավորում են RTC ստորաբաժանումները երկու մեծ բաց ընթերցման շրջանակներում (ORF) ORF1a և ORF1b, որոնք թարգմանված են գենոմային ՌՆԹ-ից:ORF1a-ն կոդավորում է պոլիպրոտեինը (pp) 1a, իսկ ORF1a-ն և ORF1b-ը համատեղ կոդավորում են pp1ab:ORF1a-ով կոդավորված հիմնական պրոթեզերոնի (Mpro) ընդհանուր մասնակցությամբ և՛ pp1a, և՛ pp1ab պրոտեոլիտիկ կերպով վերամշակվում են մի շարք ոչ կառուցվածքային սպիտակուցների (nsps), որոնք նաև հայտնի են որպես 3CLpro, քանի որ այն ունի հոմոոլոգիա պիկորնավիրուսի 3Cpro-ի հետ ( 9):Ենթադրվում է, որ այս NSPS-ները հավաքվում են մեծ դինամիկ RTC-ի մեջ, կատալիզացնում են գենոմային ՌՆԹ-ի (կրկնօրինակման) և ենթագենոմային ՌՆԹ-ի մի շարք (տրանսկրիպցիա) սինթեզը և օգտագործվում են ORF1b-ից ներքև գտնվող ORF-ի արտահայտությունը համակարգելու համար (10? ? 12):
Հիմնական RTC-ն ներառում է ՌՆԹ-ից կախված ՌՆԹ պոլիմերազը (RdRp) (13), գերընտանիքի 1 հելիկազան (HEL1) (14, 15) և մի քանի ՌՆԹ մշակող ֆերմենտներ, որոնք հիմնականում կոդավորված են ORF1b-ում և կորոնավիրուսների ընտանիքում: Այն պարունակում է nsp12-nsp16 և nsp9-nsp12 Arterioviridae ընտանիքում (տես հղում 10ââ 12):RdRp-ը և HEL1-ը ներկայացնում են թռչնի բնի վիրուսի երկու (մեկ հինգերորդը) պահպանված տիրույթները և ունեն հոմոլոգիա ՌՆԹ-ի այլ վիրուսների միջև:Ենթադրվում է, որ հիմնական ռեպլիկազին օգնում են այլ ենթամիավորներ, ներառյալ մի քանի փոքր NSPS, որոնք թողարկվել են pp1a-ի կարբոքսի-տերմինալ (C-տերմինալ) շրջանից, Mpro-ից ներքև (համապատասխանաբար, կորոնավիրուսային nsp5 և զարկերակային վիրուս nsp4):Նրանք ունեն սահմանափակ ընտանիքի հատուկ պաշտպանություն և բազմազան գործողություններ (վերանայված 10-12-ում):
Համեմատաբար վերջերս, եզակի հաջորդականության մոտիվներով տիրույթ է հայտնաբերվել RdRp-ի հարևանությամբ գտնվող ամինային վերջնակետում (N-տերմինալ) բոլոր ներդիր վիրուսներում, բայց ոչ այլ ՌՆԹ վիրուսներ (16):Հիմնվելով իր տեղակայման և նուկլեոտիդային տրանսֆերազայի (նուկլեոզիդ մոնոֆոսֆատ [NMP] տրանսֆերազա) ակտիվության վրա՝ այս տիրույթը կոչվում է NiRAN (Nestvirus RdRp-related nucleotide transferase):NiRAN-RdRp-ի կրկնակի տիրույթի համակցությունը կազմում է nsp12-ը Coronaviridae ընտանիքում և nsp9-ը՝ Arterioviridae-ի ընտանիքում, իսկ մյուս nestoviridae-ներում NiRAN-RdRp-ն ակնկալվում է, որ կթողարկվի որպես անկախ nsp վիրուսային պոլիպրոտեինից:Կորոնավիրուսում NiRAN տիրույթը պարունակում է ??1/450 մնացորդներ և միացված է C-տերմինալ RdRp տիրույթին կապող շրջանի միջոցով (16?19):Ձիերի արտրիտի վիրուսի (EAV) (Arteriviridae) դեպքում ռեկոմբինանտ nsp9-ը ցույց է տալիս Mn2+ իոնից կախված (ինքնուրույն) UMPylation և GMPylation գործունեությունը, որոնք կախված են նեստովիրուսում՝ AN, BN և CN հաջորդականության երեք պահպանված հիմքերից:Որտեղ N-ը նշանակում է NiRAN) (16):Այս մոտիվների N-տերմինալը նվազ պահպանողական նախաAN մոտիվ է:Այս մնացորդներից մի քանիսը պահպանվում են նաև հեռավոր հարակից պրոտեին կինազներում, որտեղ ցույց է տրված, որ դրանք ներգրավված են նուկլեոզիդ տրիֆոսֆատի (NTP) կապակցման և կատալիտիկ գործունեության մեջ (20, 21):Այս դիտարկմանը համահունչ՝ Pseudomonas syringae-ից պսևդոկինազի SelO-ի մի քանի հիմնական ակտիվ տեղամասի մնացորդներ կարող են հավաքվել վերջերս հրապարակված SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 սուպերհամալիրով:Կորոնավիրուսի պահպանված NiRAN մնացորդները վերցված են էլեկտրոնային միկրոկառուցվածքում:Ռեկոմբինանտ սպիտակուց (17).Ենթադրվում է, որ փաստաթղթավորված (ինքնակառավարման) U/GMPylation-ը կստեղծի անցողիկ վիճակ՝ NMP-ին տեղափոխելու համար (ներկայումս անհայտ) սուբստրատ (16), և կառուցվածքային նմանությունը NiRAN-ի և պրոտեին կինազի (17, 19) ) վարկածն է, որ NiRAN-ը փոփոխում է այլ սպիտակուցներ:
Բազմաթիվ առանձնահատկություններ, ներառյալ նրա եզակի և եզակի համակարգված կապը բնադրված վիրուսների հետ և գենետիկական անջատումը RdRp-ից, NiRAN-ը դարձնում են խելամիտ առանցքային կարգավորող ֆերմենտ ներդիր վիրուսների համար, ինչը կարևոր է դրանց առաջացման և ինքնության համար:Նախկինում երեք հնարավոր գործառույթներ, որոնք ներառում էին NiRAN-ը՝ գենոմի/ենթագենոմային թարգմանությունը կամ վերարտադրությունը/տրանսկրիպցիան կարգավորելու համար, կոչվում էին:Երբ հաշվի ենք առնում տվյալ պահին առկա սակավ և թերի տվյալները, յուրաքանչյուր գործառույթ ունի իր առավելություններն ու թերությունները (16):Այս հետազոտության մեջ մենք նպատակ ունենք համատեղել երկու սեռերը ներկայացնող կորոնավիրուսների կենսաքիմիական և հակադարձ գենետիկական ուսումնասիրությունները և մեր գտածոները դնել կորոնավիրուսների ընտանիքի բնական մուտացիայի էվոլյուցիոն ֆոնի վրա, որպեսզի պատկերացում կազմենք այս առեղծվածային ոլորտի մասին:Մենք զեկուցում ենք խոշոր առաջընթացներ NiRAN-ի ընկալման մեջ RTC-ում բնական թիրախների նույնականացման միջոցով, որը (առկա երեք վարկածների թվում) նպաստում է այս տիրույթի դերին ներդիր վիրուսի ՌՆԹ-ի սինթեզ սկսելու գործում:Այս հետազոտությունը նաև հնարավորություններ է բացում NiRAN-ի այլ դերերի համար վիրուսի հյուրընկալող միջերեսում:
Կորոնավիրուսի nsp12-ի հետ կապված NiRAN տիրույթի ֆերմենտային հատկությունները բնութագրելու համար մենք արտադրեցինք մարդու կորոնավիրուսի 229E (HCoV-229E) nsp12-ի ռեկոմբինանտ ձև E. coli-ում, C-վերնամասում His6 պիտակով և միավորեցինք սպիտակուցը [α32-P]-ով Ինկուբացնել NTP-ի հետ միասին MnCl2-ի առկայության դեպքում, ինչպես նկարագրված է «Նյութեր և մեթոդներ» բաժնում:Ռեակցիայի արտադրանքի վերլուծությունը ցույց է տվել ռադիոպիտակավորված սպիտակուցի առկայություն, որը համատեղ արտագաղթում է nsp12-ի հետ (106 կԴա), ինչը ցույց է տալիս, որ կորոնավիրուսը nsp12-ը կատալիզացնում է կովալենտային սպիտակուց-NMP հավելումների ձևավորումը, որը գերադասելիորեն ձևավորվում է ուրիդին մոնոֆոսֆատով (UMP) (Նկար 1A) և Բ).Քանակական վերլուծությունը ցույց է տվել, որ համեմատած այլ նուկլեոտիդների հետ, UMP-ի ներդրման ազդանշանի ինտենսիվությունը աճել է 2-3 անգամ (Նկար 1C):Այս տվյալները համապատասխանում են կորոնավիրուսի NiRAN տիրույթի կանխատեսված NMP տրանսֆերազային ակտիվությանը (16), սակայն ցույց են տալիս, որ կորոնավիրուսի NiRAN տիրույթի և զարկերակային վիրուսի նուկլեոտիդային նախապատվությունները տարբեր են:
HCoV-229E nsp12-ի ինքնանմպիլացման ակտիվություն:(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 կԴա) ինկուբացվել է նշանակված [α-32P] NTP-ով 6 մՄ MnCl2-ի ներկայությամբ 30 րոպե (մանրամասների համար տե՛ս Նյութեր և մեթոդներ):Ռեակցիայի արտադրանքներն առանձնացվել են SDS-PAGE-ով և ներկվել Coomassie փայլուն կապույտով:(B) Ռադիոպիտակավորված սպիտակուցը տեսանելի է ֆոսֆորի պատկերման միջոցով:nsp12-His6-ի և սպիտակուցի մոլեկուլային զանգվածի մարկերների դիրքերը (կիլոդալտոններով) ներկայացված են A և B-ում: (C) Ռադիոակտիվ ազդանշանի ինտենսիվությունը (միջին ± SEM) որոշվել է երեք անկախ փորձերից:*P≤0.05.Ազդանշանի հզորությունը (տոկոսը) կապված է UTP-ի հետ:
Չնայած ցույց է տրվել, որ NiRAN-ի հետ կապված ֆերմենտային ակտիվությունը էական է բջիջների կուլտուրայում EAV-ի և SARS-CoV-ի վերարտադրության համար (16), NiRAN-ի հատուկ գործառույթը և հնարավոր թիրախները դեռևս որոշված չեն:Վերջերս հաղորդված կառուցվածքային նմանությունը NiRAN-ի և սպիտակուցային կինազային ծալքերով սպիտակուցների ընտանիքի միջև (17, 22) մեզ դրդեց փորձարկել այն վարկածը, որ NiRAN-ը կատալիզացնում է այլ սպիտակուցների NMPylation-ը:Մենք ստեղծեցինք մի շարք պոտենցիալ հոմոլոգ թիրախներ, ներառյալ ոչ կառուցվածքային սպիտակուցներ, որոնք կոդավորված են HCoV-229E ORF1a-ով (nsps 5, 7, 8, 9, 10), որոնցից յուրաքանչյուրը պարունակում է C-տերմինալ His6 պիտակ (SI հավելված, Աղյուսակ S1), և ինկուբացնել այս սպիտակուցները [α32-P] ուրիդին տրիֆոսֆատով ([α32-P]UTP) nsp12-ի առկայության կամ բացակայության դեպքում:Տավարի շիճուկի ալբումինը և E. coli-ում արտադրված MBP-LacZα միաձուլված սպիտակուցը ծառայում էին որպես հսկիչներ (Նկար 2Ա, գծեր 1-ից 7):Ռադիոպիտակավորված սպիտակուցը վերլուծվել է նատրիումի դոդեցիլսուլֆատ-պոլիակրիլամիդ գել էլեկտրոֆորեզի (SDS-PAGE) և ավտոռադիոգրաֆիայի միջոցով, և պարզվել է, որ nsp12 և nsp9 պարունակող ռեակցիայում առկա է ուժեղ ռադիոակտիվ ազդանշան:Ազդանշանի դիրքը համապատասխանում է nsp9-ի մոլեկուլային զանգվածին, ինչը ցույց է տալիս nsp9-ի nsp12-ի միջնորդությամբ UMPylation (Նկար 2B, ուղի 7):Ոչ մի այլ փորձնական սպիտակուց չի հայտնաբերվել UMPylated, ինչը հանգեցրեց մեզ եզրակացության, որ nsp9-ը nsp12-ի հատուկ սուբստրատ է:Նկար 1-ում ցուցադրված ինքնա-NMPylation տվյալներին համապատասխան՝ nsp12-ը կարող է փոխանցել բոլոր չորս NMP-ները nsp9, չնայած արդյունավետությունը տարբեր է, UMP> ադենոզին մոնոֆոսֆատ (AMP)> գուանոզին մոնոֆոսֆատ (GMP)> ցիտիդին մոնոֆոսֆատ (CMP) Նկար):3 A և B):Այս վերլուծության մեջ օգտագործվող պայմաններում (կարճացնել ռեակցիան և ազդեցության ժամանակը, նվազեցնել nsp12-ի կոնցենտրացիան, նյութեր և մեթոդներ), nsp12-ի ինքնա-NMPիլացումը հնարավոր չէր հայտնաբերել (համեմատեք Նկար 2B, 7-րդ գիծ և Նկար 1B), որը ապացուցեց արդյունավետ (Եվ մի քանի փուլ) UMP-ը nsp12-ից տեղափոխվեց nsp9:UMP տրանսֆերազայի ակտիվությունը պահանջում է Mn2+ իոնների առկայություն, ինչպես ցույց է տրված Նկար 3C-ում, մինչդեռ Mg2+-ի առկայության դեպքում նկատվել է միայն նվազագույն UMP տրանսֆերազայի ակտիվություն, և փորձարկված մյուս երկու երկվալենտ կատիոնների առկայության դեպքում ոչ մի ակտիվություն:Նմանատիպ տվյալներ են ստացվել NMPylation վերլուծություններում, որոնք պարունակում են ցիտիդին տրիֆոսֆատ (CTP), գուանոզին տրիֆոսֆատ (GTP) և ադենոզին տրիֆոսֆատ (ATP) (SI հավելված, Նկար S1):
HCoV-229E nsp12 միջնորդավորված nsp9-ի UMPylation:Մի շարք սպիտակուցային սուբստրատներ (ներառյալ տավարի շիճուկի ալբումինը, MBP-lacZα-ն և մի շարք HCoV-229E nsps, որոնք պիտակավորված են C-տերմինալ His6-ով, որը կոդավորված է ORF1a-ով) օգտագործվել են HCoV-229E nsp12-His6⁺-միջամտված UMPylation ակտիվությունը գնահատելու համար: սպիտակուցը.Ինկուբացնել սպիտակուցը [α-32P] UTP-ով 10 րոպե nsp12-ի (A) կամ (B) բացակայության դեպքում, ինչպես նկարագրված է նյութերում և մեթոդներում:A-ի և B-ի վերևում ցուցադրվում է SDS-պոլիակրիլամիդ գելը, որը ներկված է Coomassie Brilliant Blue-ով, իսկ A-ի և B-ի ներքևում՝ համապատասխան ավտոռադիոգրամները:Ձախ կողմում տրված է սպիտակուցի մոլեկուլային զանգվածի մարկերի դիրքը (կիլոդալտոններով):Նշված են նաև nsp12-His6-ի դիրքը (B, վերև) և ռադիոակտիվ ազդանշանը, որը դիտվել է nsp12-His6-ի ինկուբացիայի ժամանակ nsp9-His6-ով (B, նրբ. 7), ինչը ցույց է տալիս, որ [α-32P]UMP-ից մինչև nsp9-His6: (12,9 կԴա), որը չի նկատվել փորձարկված այլ սպիտակուցների համար:
HCoV-229E NiRAN-ով միջնորդավորված nsp9 NMPylation-ի կենսաքիմիական և վիրուսաբանական բնութագրում:(A և B) Նուկլեոտիդային համասուբստրատի դերը, որն օգտագործվում է ռեակցիայում:Nsp12-His6-ը և nsp9-His6-ը խառնվում և ինկուբացվում են տարբեր [α-32P] NTP-ների առկայության դեպքում NMPylation ստանդարտ վերլուծության մեջ:(A, վերև) Coomassie-ով ներկված nsp9-His6 առանձնացված SDS-PAGE-ով:(Ա, ներքև) Գելի նույն տարածքի ավտոռադիոգրաֆիա:(B) Հարաբերական ակտիվությունը (միջին ± SEM) նշանակված նուկլեոտիդային կոֆակտորի առկայության դեպքում որոշվում է երեք անկախ փորձերից:*P≤0.05.(C) Մետաղական իոնների դերը.Ցուցադրված է ստանդարտ NMPylation թեստը [α-32P] UTP-ի և տարբեր մետաղական իոնների առկայության դեպքում՝ յուրաքանչյուրը 1 մՄ կոնցենտրացիայով:C-ում վերևում ցուցադրվում է Coomassie-ի ներկված nsp9-His6-ը, իսկ C-ում՝ ներքևում, ցուցադրվում է համապատասխան ավտոռադիոգրաֆիա:Նշված սպիտակուցի չափը (կիլոդալտոններով) ցուցադրված է A-ից և C-ից ձախ: (D) HCoV-229E nsp12-His6-ի մուտանտ ձևը, որը կրում է նշված ամինաթթվի փոխարինումը, գտնվում է [α-32P]UTP-ում, ինչպես նկարագրված է: նյութերի և մեթոդների մեջ:Ռադիոպիտակավորված nsp9-His6-ը, որը արտադրվում է NMPylation ռեակցիայի մեջ, հայտնաբերվում է ֆոսֆորիլացման պատկերման միջոցով (D, վերև):Հարաբերական ակտիվությունը, համեմատած վայրի տիպի (wt) սպիտակուցի հետ, ցուցադրված է D-ում, իսկ ներքևը վերցված է որպես միջին (±SEM) երեք անկախ փորձից:Աստղանիշները ցույց են տալիս չպահպանված մնացորդների փոխարինում:(E) Վիրուսի տիտրը p1 բջիջների կուլտուրայի վերին նյութում, որը ստացվել է վարակվելուց 24 ժամ հետո, որոշվել է ափսեի վերլուծությամբ:Նշված են ինժեներական HCoV-229E մուտանտի NiRAN տիրույթում կոդոնի փոխարինումները (մնացորդների համարակալումը հիմնված է pp1ab-ում նրանց դիրքի վրա):Որպես հսկիչ օգտագործվել է կրկնօրինակման պակաս ունեցող RdRp ակտիվ կայքի մուտանտը՝ nsp12_DD4823/4AA:
NiRAN-ի ակտիվ վայրի մասին ավելի խորը պատկերացում կազմելու և nsp9-հատուկ NMP տրանսֆերազայի գործունեության հետ կապված մնացորդները որոշելու համար մենք կատարեցինք մուտացիոն վերլուծություն, որում մենք փոխարինեցինք պահպանողական մնացորդները NiRAN AN, BN և CN մոտիվներով ( 16) Դա Ալա է (SI հավելված, Նկար S2):Բացի այդ, պահպանողական Arg-ից-Lys կամ Lys-to-Arg փոխարինումների ազդեցությունը գնահատվել է երկու դեպքում:Որպես (բացասական) հսկողություն, մնացորդները, որոնք կամ պակաս պահպանված չեն կորոնավիրուսների և այլ ներդիր վիրուսների NiRAN տիրույթում, փոխարինվում են Ala-ով: Փոխարինելով K4116A-ն (preAN մոտիվով), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (մոտիվ): BN) և D4280A (CN) զգալիորեն նվազեցնում կամ նույնիսկ վերացնում են nsp9 NMPylation-ը nsp12-ի միջոցով, մինչդեռ պահպանողական փոխարինումներով սպիտակուցները (R4178K), K4116R) պահպանում են իրենց ակտիվության 60% և 80%-ը, ինչը ցույց է տալիս, որ սահմանափակումների թուլացումը իրենց համապատասխան կողմում շղթաները ֆիզիկաքիմիական զգայուն են (Նկար 3D):E4145A, D4273A, F4281A և D4283A մի քանի այլ պահպանված մնացորդների փոխարինումը շատ ավելի քիչ վնասակար է, իսկ nsp9 UMPylation-ը միայն չափավոր նվազում է:Նմանատիպ արդյունքներ են ստացվել nsp9 NMPylation ռեակցիաներում, որոնք ներառում են այլ NTP-ներ (Նկար 3D և SI հավելված, Նկար S3), հաստատելով, որ դիտարկված ազդեցությունները կոնկրետ ամինաթթուների փոխարինումների վրա անկախ են օգտագործվող նուկլեոտիդային համասուբստրատի տեսակից:Հաջորդը, մենք փորձարկեցինք այս nsp12 փոխարինումների հնարավոր ազդեցությունը բջիջների կուլտուրայում կորոնավիրուսների վերարտադրության վրա:Այդ նպատակով մենք օգտագործեցինք համապատասխան գենետիկորեն մշակված կոմպլեմենտար ԴՆԹ (cDNA) ձևանմուշներ, որոնք կլոնավորված էին ռեկոմբինանտ վակցինիա վիրուսում (23, 24)՝ 5-7 բջիջ արտագրելու համար:Այս բջիջներում արտադրված վարակիչ վիրուսի սերունդների տիտրումը ցույց տվեց, որ HCoV-229E NiRAN մուտանտների մեծ մասը հնարավոր չէ իրականացնել (Նկար 3E):Ոչ կենսունակ վիրուսային մուտանտների խումբը ներառում է այլընտրանքներ, որոնք ապացուցված են, որ վերացնում կամ զգալիորեն նվազեցնում են NMP տրանսֆերազայի ակտիվությունը in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), բայց կան երկու այլ այլընտրանքներ (K4116R, E48145) % վերապահվա՞ծ էՆրանց in vitro NMPylation գործունեությունը ցույց է տալիս, որ ներգրավված են լրացուցիչ սահմանափակումներ:Նմանապես, երկու այլ մուտացիաներ (R4178K, F4281A), որոնք առաջացրել են NiRAN-ի in vitro NMPylation ակտիվության չափավոր նվազում, արտադրել են կենդանի վիրուսներ, սակայն այդ վիրուսները զգալիորեն կրճատել են տիտրերը վերարտադրության միջոցով:Նկար 3D-ում ներկայացված in vitro գործունեության տվյալներին համապատասխան՝ փոխարինելով չորս այլ մնացորդներ, որոնք չեն պահպանվել կորոնավիրուսներում և/կամ այլ ներդիր վիրուսներում (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) արտադրել են կենսունակ վիրուսներ։ չափավոր կրճատված տիտր՝ համեմատած վայրի տիպի վիրուսի (Նկար 3E):
Ուսումնասիրելու համար, թե արդյոք NiRAN-ի միջնորդավորված NMP տրանսֆերազայի ակտիվությունը կախված է ակտիվ RdRp տիրույթից, երկու պահպանված Asp մնացորդները, որոնք ներգրավված են երկվալենտ մետաղական իոնների կոորդինացման մեջ (11) RdRp մոտիվ C-ում, փոխարինվեցին Ala-ով: Ստացված nsp12_DD4823/4AA սպիտակուցը պահպանվում է: դրա nsp9 NMPylation ակտիվությունը, որը ցույց է տալիս, որ nsp12-ով միջնորդավորված in vitro nsp9 NMPylation ակտիվությունը չի պահանջում պոլիմերազային ակտիվություն (SI Հավելված, Նկար S4):
nsp12-ի համար nsp9-ին հատուկ NMP տրանսֆերազայի ակտիվությունը հաստատելուց հետո մենք փորձեցինք բնութագրել NMP-nsp9 հավելումը զանգվածային սպեկտրաչափությամբ (MS):Recombinant HCoV-229E nsp9-ի ամբողջական սպիտակուցային զանգվածային սպեկտրը ցույց է տվել գագաթնակետ 12045 Da (Նկար 4A):nsp12-ի ավելացումը չփոխեց nsp9-ի որակը, ինչը ցույց է տալիս, որ nsp12-ը և nsp9-ը չեն ձևավորի կայուն համալիր օգտագործվող պայմաններում (դենատուրացիա) (Նկար 4Ա):UTP-ի և GTP-ի առկայության դեպքում nsp9 և nsp12 պարունակող ռեակցիայի զանգվածի չափումը ցույց է տվել, որ UTP-ի սպիտակուցային զանգվածը տեղափոխվել է 306 Da, իսկ GTP-ի սպիտակուցային զանգվածը՝ 345 Da, ինչը ցույց է տալիս, որ յուրաքանչյուր nsp9 մոլեկուլ կապում է UMP կամ GMP: (Նկար 4) C և D):Ենթադրվում է, որ NiRAN-ով միջնորդավորված nsp9 NMPylation-ի համար պահանջվող էներգիան ստացվում է NTP հիդրոլիզից և պիրոֆոսֆատի արտազատումից:Թեև այս ռեակցիայում օգտագործվել է nsp9-ի (թիրախ) 10 անգամ մոլային ավելցուկ, քան nsp12-ը (ֆերմենտը), նկատվել է nsp9-ի գրեթե ամբողջական NMPylation, ինչը ցույց է տալիս, որ nsp12-ի և nsp9-ի փոխազդեցությունը կարճատև է, և nsp12-ը կարող է NMPyate ավելի շատ nsp9: in vitro մոլեկուլ.
nsp9-ի մեկ NMPylation nsp12-ի և UTP-ի կամ GTP-ի առկայության դեպքում:Ցուցադրված է HCoV-229E nsp9-ի խճճված ամբողջական սպիտակուցային զանգվածային սպեկտրը (SI հավելված, Աղյուսակ S1) (AD):(A) nsp9 միայնակ, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 UTP-ի առկայության դեպքում, (D) nsp9 + nsp12-His6 GTP-ի առկայության դեպքում:
nsp9 մնացորդները որոշելու համար UMPylated nsp12-ով, nsp9-UMP-ը տրիպսինով բաժանվեց:Ստացված պեպտիդներն առանձնացվել են նանո-բարձր արդյունավետության հեղուկ քրոմատագրմամբ (HPLC) և վերլուծվել առցանց տանդեմ զանգվածային սպեկտրաչափությամբ (MS/MS):Տվյալների վերլուծությունը՝ օգտագործելով Byonic ծրագրային փաթեթը (Protein Metrics) ցույց է տվել N-տերմինալ ամինաթթվի UMPylation:Սա հաստատվում է ձեռքով:[UMP]NNEIMPGK պրեկուրսոր պեպտիդի տանդեմի զանգվածային սպեկտրը (SI հավելված, Նկար S5A) բացահայտեց մի հատված 421 մ/ց արագությամբ՝ ցույց տալով, որ UMP-ը կապվում է nsp9-ի մնացորդի 1-ին:
nsp9-ի N վերջնամասում Asn-ը պահպանվում է Orthocoronavirinae-ի անդամների մեջ (SI հավելված, Նկար S6):Թեև մենք կարծում ենք, որ N-տերմինալ առաջնային ամին ազոտը UMP-ի ամենահավանական ընդունողն է, մենք որոշեցինք NMP-ի կապակցման լրացուցիչ ապացույցներ ստանալ N-տերմինալում:Այս պատճառով, HPLC-ով մաքրված ոչ NMPylated և NMPylated N-տերմինալ պեպտիդը nsp9 ստացվել է ացետոնի և նատրիումի ցիանոբորոհիդրիդի առկայության դեպքում:Այս պայմաններում միայն ազատ առաջնային ամինները կարող են փոփոխվել պրոպիլով (25):N-տերմինալ nsp9-ից ստացված պեպտիդը՝ NNEIMPGK հաջորդականությամբ, պարունակում է երկու առաջնային ամիններ՝ մեկը Asn-ի N-վերնամասում, իսկ մյուսը՝ Lys-ի կողային շղթայում՝ C- վերջնամասում:Հետևաբար, պրոպիլային խմբերը կարող են ներդրվել երկու ծայրերում:Ոչ NMPylated պեպտիդների արդյունահանված իոնային քրոմատոգրամները ներկայացված են SI հավելվածում, Նկար S5B:Ինչպես և սպասվում էր, կարելի է նույնացնել N-տերմինալ և C-տերմինալ (մոնո)պրոպիլացված (SI հավելված, Նկար S5B, վերին գիծ) և երկպրոպիլացված պեպտիդներ (SI հավելված, Նկար S5B, ստորին գոտի):Այս օրինաչափությունը փոխվում է nsp9-ի NMPylated N-տերմինալ պեպտիդի օգտագործմամբ:Այս դեպքում միայն C-տերմինալ պրոպիլացված պեպտիդները կարող են նույնականացվել, բայց N-տերմինալ պրոպիլացված պեպտիդները և դիպրոպիլացված պեպտիդները նույնականացված չեն (SI Հավելված, Նկար S5C), ինչը ցույց է տալիս, որ UMP-ը փոխանցվել է N-տերմինալ առաջնային ամին Սա կանխելու համար: խումբը փոփոխություններ կատարելուց:
Հաջորդը, մենք փոխարինում ենք (Ala-ով կամ Ser-ով) կամ ջնջում պահպանված մնացորդները nsp9-ի N-վերջում՝ սահմանելու նպատակային հատուկ սահմանափակումներ:Ելնելով մեր MS տվյալներից, որոնք ցույց են տալիս, որ NiRAN-ը ձևավորում է nsp9-NMP հավելում nsp9-ի N-տերմինալ մնացորդի առաջնային ամինով, մենք ենթադրեցինք, որ nsp9 NMPylation-ը պահանջում է վիրուսային հիմնական պրոթեզերա (Mpro, nsp5)՝ ազատելու nsp9 N-տերմինալը: դրա պոլիպրոտեինային նախադրյալը:Այս վարկածը ստուգելու համար մենք E. coli-ում արտադրեցինք nsp9 պարունակող nsp9 պրեկուրսոր սպիտակուց և կատարեցինք ստանդարտ NMPylation թեստ [α-32P] UTP-ի (նյութեր և մեթոդներ) առկայությամբ:Ինչպես ցույց է տրված Նկար 5Ա-ում (3-րդ գիծ), չկտրված nsp7-11 պրեկուրսորը ռադիոպիտակավորված չէ nsp12-ով:Ի հակադրություն, եթե nsp7-11-ը ճեղքվում է ռեկոմբինանտ nsp5-ով, որպեսզի ազատի nsp9 (և այլ nsps) պրեկուրսորից, ապա հայտնաբերվում է ռադիոպիտակավորված սպիտակուց, որը գաղթում է nsp9-ով, հաստատելով մեր եզրակացությունը, որ NiRAN և N- ընտրովի ձևավորումը կովալենտային nsp9-NMP հավելումների: .N-տերմինալ Asn-ի վերջնական առաջնային ամինը (3825 դիրքը pp1a/pp1ab-ում):Այս եզրակացությունը հաստատվում է նաև nsp9 կոնստրուկցիայի օգտագործմամբ փորձերով, որը պարունակում է մեկ կամ երկու լրացուցիչ մնացորդներ N-տերմինալում:Երկու դեպքում էլ NiRAN-ի միջնորդությամբ nsp9-ի UMPylation-ը վերացվել է (SI Հավելված, Նկար S7):Հաջորդը, մենք արտադրեցինք սպիտակուց մեկ կամ երկու Asn մնացորդներով, որոնք ջնջվել էին 3825-NNEIMPK-3832 պեպտիդային հաջորդականությունից nsp9-ի N-տերմինալում:Երկու դեպքում էլ nsp9 UMPylation-ը ամբողջությամբ արգելափակվել է (Նկար 5B)՝ ապահովելով լրացուցիչ ապացույց, որ իրական nsp9 N-վերջը գործում է որպես NMP ընկալիչ:
nsp9-ի պրոտեոլիտիկ մշակումը և N-տերմինալ մնացորդների դերը nsp12 միջնորդավորված UMPylation-ում:(A) nsp9 UMPylation-ը պահանջում է անվճար nsp9 N-տերմինալ:Nsp7-11-His6-ը նախապես ինկուբացվում է 30 °C ջերմաստիճանում NMPylation հայտնաբերման բուֆերում, որը պարունակում է UTP՝ ռեկոմբինանտ Mpro-ի առկայության կամ բացակայության դեպքում (nsp5-His6):3 ժամ հետո սկսեք NMPylation վերլուծությունը՝ ավելացնելով nsp12-His6, ինչպես նկարագրված է «Նյութեր և մեթոդներ» բաժնում:Որպես հսկիչ օգտագործվել է nsp5-His6 (1-ին գիծ) և nsp9-His6 (երթուղի 2) պարունակող ռեակցիան:10 րոպե հետո ռեակցիան դադարեցվել է և ռեակցիայի խառնուրդն առանձնացվել է SDS-PAGE-ով:Սպիտակուցը ներկվել է Coomassie Brilliant Blue-ով (A, վերև):Nsp7-11-His6 պրեկուրսորը և nsp5-His6 միջնորդավորված ճեղքման արդյունքում ստացված վերամշակված արտադրանքը ցուցադրված են աջ կողմում:Խնդրում ենք նկատի ունենալ (իրենց փոքր չափերի պատճառով), որ nsp7-ը և nsp11-His6-ը չեն հայտնաբերվել այս գելում, և ռեակցիան լրացվում է nsp5-His6-ով (1-ին և 4-րդ գծերը. nsp5-His6-ի դիրքը նշված է ամուր շրջանով) կամ nsp9-His6 (Lane 2) պարունակում է փոքր քանակությամբ MBP (նշված է բաց շրջանակներով) որպես մնացորդային կեղտեր, քանի որ դրանք արտահայտված են որպես MBP միաձուլման սպիտակուցներ (SI հավելված, Աղյուսակ S1):(B) Nsp9-His6 տարբերակում բացակայում են մեկ կամ երկու N-տերմինալ Asn մնացորդներ (մնացորդների համարակալում ըստ դիրքի pp1a/pp1ab-ում) և մաքրվում և ինկուբացվում է nsp12-His6 և [α-32P] UTP-ով:B, SDS-PAGE-ը՝ ներկված Coomassie-ով, ցուցադրված է վերևում, B, համապատասխան ավտոռադիոգրաֆը՝ ներքևում:Ձախ կողմում ցուցադրված է մոլեկուլային քաշի մարկերի դիրքը (կիլոդալտոններով):(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-տերմինալի պահպանված մնացորդները փոխարինվել են Ala-ով կամ Ser-ով, և նույն քանակությամբ սպիտակուցը օգտագործվել է nsp12-His6 միջնորդավորված UMPylation ռեակցիայում:Ռեակցիայի արտադրանքներն առանձնացվել են SDS-PAGE-ով և ներկվել Coomassie Brilliant Blue-ով (C, վերև), և ռադիոպիտակավորված nsp9-His6-ը հայտնաբերվել է ֆոսֆորեսցենտային պատկերման միջոցով (C, միջին):Օգտագործելով վայրի տիպի (wt) սպիտակուցը որպես հղում (սահմանված է 100%), հարաբերական NMPylation ակտիվությունը (միջին ± SEM) հաշվարկվել է երեք անկախ փորձերից:(D) HCoV-229E վայրի տիպի Huh-7 բջիջներով վարակված Huh-7 բջիջների p1 բջիջների կուլտուրայի վերին նյութում վիրուսի տիտրերը և nsp9-ում նշանակված ամինաթթուների փոխարինումներ կրող մուտանտները որոշվել են ափսեի վերլուծությամբ:Որպես բացասական հսկողություն օգտագործվել է կրկնօրինակման անբավարարությամբ RdRp մոտիվը C կրկնակի մուտանտ DD4823/4AA:
nsp9-ի N վերջնակետը (հատկապես 1, 2, 3 և 6 դիրքերը) շատ պահպանված է Orthocoronavirinae ենթաընտանիքի անդամների շրջանում (SI հավելված, Նկար S6):Այս մնացորդների հնարավոր դերը nsp12-ով միջնորդավորված nsp9 NMPylation-ում ուսումնասիրելու համար nsp9-ի N-վերնամասում երկու հաջորդական Asn մնացորդներ փոխարինվեցին Ala կամ Ser-ով (մենակ կամ համակցված):Վայրի տիպի nsp9-ի համեմատ, N3825-ը Ala-ով կամ Ser-ով փոխարինելը հանգեցրեց nsp12-ով միջնորդավորված UMPylation-ի ավելի քան երկու անգամ կրճատմանը (Նկար 5C):Համահունչ մեր եզրակացությանը, որ NMPylation-ը տեղի է ունենում N-տերմինալ առաջնային ամինում՝ N-տերմինալ մնացորդի կողային շղթայի փոխարեն, մենք նկատեցինք զգալի մնացորդային NMPylation՝ փոխարինելով N3825A և N3825S:Հետաքրքիր է, որ եթե երկրորդ Asn-ը փոխարինվում է Ala-ով կամ Ser-ով, nsp9 UMPylation-ն ավելի ուժեղ է նվազում (ավելի քան 10 անգամ), մինչդեռ Ala-ի փոխարինումը 3, 4 և 6 դիրքերում ունի միայն չափավոր ազդեցություն nsp9 UMPylation-ի վրա (Նկար 2): ) .5C):Նմանատիպ արդյունքներ են ստացվել ATP-ի, CTP-ի կամ GTP-ի միջոցով (SI հավելված, Նկար S8):Ընդհանուր առմամբ, այս տվյալները ցույց են տալիս N2826-ի (2-րդ դիրքը nsp9-ում) առանցքային դերը nsp9 NMPylation-ում:
Որպեսզի ձեռք բերենք nsp9-ի և NMPylation-ի N-վերնամասի ֆունկցիոնալ հարաբերակցության լրացուցիչ ապացույցներ, մենք կատարեցինք Coronavirus ընտանիքի nsp9 հաջորդականության բազմակի հաջորդականության հավասարեցում (MSA) (տարբերվում է 104 և 113 մնացորդների միջև) (SI Հավելված, Նկար: S6):Ընդհանուր առմամբ, Orthocoronavirinae ենթաընտանիքի 5 ցեղերի 47 (հայտնի և ենթադրյալ) տեսակների մեջ, որոնք վարակում են տարբեր կաթնասունների, թռչունների և սողունների հյուրընկալողներին, ընդամենը 8 մնացորդ է հայտնաբերվել անփոփոխ:Առավել ընդարձակ փոփոխությունները, ներառյալ ջնջումները և ներդիրները, նկատվել են nsp9-ի երկրորդական կառուցվածքի տարրերի միջև ընկած ցիկլերում, ինչպես որոշվել է նախորդ կառուցվածքային ուսումնասիրություններով (26 ??28):nsp9-ի C-տերմինալ մասի β շղթայում և α պարույրում հայտնաբերվել են հինգ անփոփոխ մնացորդներ:Երեք անփոփոխ մնացորդներ կազմում են nsp9-ի N վերջնամասի NNE մոտիվը:Բացահայտվում է, որ այս մոտիվի երկրորդ Ասն-ը միակ անփոփոխ մնացորդն է, որը նույնպես կիսում է հեռավորորեն կապված գորտերի կորոնավիրուսի հիպոթետիկ nsp9-ը, և ներկայացնում է Microhyla letovirus 1 տեսակը Alphaletovirus-ի Letovirinae ենթաընտանիքում:nsp9 երկրորդական կառուցվածքի տարրերի մնացորդների պահպանումը կարող է ռացիոնալացվել կառուցվածքային նկատառումներով՝ պահպանելու ծալովի կամ հայտնի ՌՆԹ-ի կապող հատկությունները:Այնուամենայնիվ, այս հիմնավորումը, կարծես, չի վերաբերում NNE-ի պահպանմանը, և մինչ այս ուսումնասիրությունը, սահմանափակումների բնույթը, որոնք սահմանափակում են եռապեպտիդային հաջորդականության փոփոխությունը, ամբողջովին մթագնված էր:
Կորոնավիրուսի վերարտադրության մեջ nsp9-NMPylation-ի և NNE-ի պահպանման կարևորությունը որոշելու համար մենք արտադրեցինք HCoV-229E մուտանտներ, որոնք կրում են nsp9 N-տերմինալ մնացորդների մեկ կամ կրկնակի փոխարինումներ՝ ցույց տալով, որ nsp9 NMPylation-ը վնասակար է in vitro:Նախքան սկսելը, մենք փորձում ենք պատասխանել այն հարցին, թե արդյոք այս փոխարինումները (nsp8|9 ճեղքման վայրի մոտ) ազդում են C-տերմինալ pp1a շրջանի պրոտեոլիտիկ վերամշակման վրա:nsp7-11 պոլիպրոտեինային կոնստրուկցիաների մի շարք, որոնք պարունակում են համապատասխան փոխարինումներ nsp9-ի N-վերնամասում, արտադրվել են E. coli-ում և կտրվել են ռեկոմբինանտ Mpro-ով:Չորս տեղամասերի պրոտեոլիտիկ տրոհման վրա (ներառյալ nsp9 կողային տեղամասը) էականորեն չի ազդում ներդրված փոխարինումները (SI հավելված, Նկար S9), բացառելով այս սպիտակուցների կառուցվածքային փոփոխությունները, որոնք խանգարում են Mpro միջնորդավորված nsp8|9 ճեղքին (կամ այլ) կայք։
Huh-7 բջիջները տրանսֆեկցվել են գենոմի երկարությամբ HCoV-229E ՌՆԹ-ով, որը կոդավորում է Ala կամ Ser փոխարինումները պահպանված NNE տրիպեպտիդներում (N3825, N3826 և E3827) nsp9 N վերջնամասում՝ ցույց տալով, որ մուտացիաների մեծ մասը մահացու է:Մենք կարողացանք փրկել վիրուսը՝ փոխարինելով N-տերմինալի Asn-ի Ser-ը կամ Ala-ն (N2835A կամ N2835S), սակայն չհաջողվեց վերականգնել վիրուսը NNE հաջորդականության այլ միայնակ և կրկնակի մուտացիաներով (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS) , E3827A) (Նկար 5D):
Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ հյուսվածքների կուլտուրաներում կորոնավիրուսների վերարտադրությունը սահմանափակ է (նույն կամ նման), սահմանափակելով nsp9 NMPylation տեղամասերի բնական մուտացիան մարմնում և աջակցելով այս արձագանքի առանցքային դերին կորոնավիրուսների կյանքի ցիկլում:
Փորձերի վերջին փաթեթում մենք արտադրեցինք C-տերմինալ His6 պիտակավորված SARS-CoV-2 nsp12 և nsp9, և nsp12-ի երկու մուտանտ ձևեր E. coli-ում:Ակտիվ կայքի մնացորդները NiRAN և RdRp տիրույթներում համապատասխանաբար Օգտագործեք Ala փոխարեն (Նկար 6A և SI հավելված, Աղյուսակ S2):K4465-ը SARS-CoV-2 nsp12-ում համապատասխանում է K4135-ին HCoV-229E-ում (SI Հավելված, Նկար S2), որն ապացուցված է, որ անհրաժեշտ է NiRAN-ի գործունեության և HCoV-229E-ի վերարտադրության համար (Նկար 3D և E):Այս մնացորդը նաև համապատասխանում է EAV nsp9 K94 զարկերակային վիրուսի մնացորդին, որը նախկինում ցույց է տրվել, որ անհրաժեշտ է NiRAN-ի ինքնա-UMPylation/self-GMPylation-ի համար (16):Ինչպես ցույց է տրված Նկար 6B-ում, SARS-CoV-2 nsp12-ն ունի UMP տրանսֆերազայի ակտիվություն՝ օգտագործելով nsp9 որպես սուբստրատ, մինչդեռ nsp12_K4465A ակտիվ կայքի մուտանտը ոչ ակտիվ է:Կրկնակի փոխարինումը SDD-ի բնորոշ հաջորդականությամբ RdRp մոտիվ C-ում չի ազդում UMP տրանսֆերազայի ակտիվության վրա (Նկար 6B), ինչը ցույց է տալիս, որ RdRp ակտիվությունն ուղղակի ազդեցություն չունի nsp9 UMPylation-ում:Նմանատիպ տվյալներ են ստացվել CTP-ի, GTP-ի և ATP-ի միջոցով (SI հավելված, Նկար S10):Ամփոփելով, այս տվյալները ցույց են տալիս, որ NiRAN-ով միջնորդավորված nsp9 NMPylation-ը պահպանողական ակտիվություն ունի օրթոկորոնավիրուսների ենթաընտանիքի տարբեր սեռեր ներկայացնող կորոնավիրուսներում:
SARS-CoV-2 nsp12-ով միջնորդավորված nsp9-ի NMPylation.(A) Coomassie ներկված SDS-պոլիակրիլամիդ գել, որը ցույց է տալիս NMPylation թեստում օգտագործվող ռեկոմբինանտ սպիտակուցը:Որպես հսկողություն՝ օգտագործվել է մուտանտ սպիտակուց՝ ակտիվ տեղամասի փոխարինմամբ SARS-CoV-2 nsp12-ի NiRAN տիրույթում (K4465A) և RdRp տիրույթում (DD5152/3AA):Մնացորդների համարակալումը հիմնված է pp1ab-ի դիրքի վրա:(B) UMPylation-ի հայտնաբերման ավտոռադիոգրաֆիա՝ օգտագործելով nsp9-His6 և [α-32P]UTP որպես nsp12-His6-ի ենթաշերտ (վայրի տիպ [wt] և մուտանտ):Մակնշված սպիտակուցի մոլեկուլային զանգվածը (կիլոդալտոններով) ցուցադրված է ձախ կողմում։
ՆիՐԱՆ տիրույթները հիմնականում պահպանված են Nidovirales-ում (16), ինչը ցույց է տալիս, որ դրանք կատալիզացնում են ֆերմենտային ռեակցիաները, որոնք կարևոր են նիդովիրուսի վերարտադրության համար:Այս ուսումնասիրության ընթացքում մենք կարողացանք ապացուցել, որ կորոնավիրուսի NiRAN տիրույթը փոխանցում է NMP (ստեղծված NTP-ից) դեպի nsp9՝ խորհրդավոր ՌՆԹ կապող սպիտակուց, որը ներգրավված է վիրուսի վերարտադրության մեջ (26 ?? 29), որոշելու այն որպես բնական թիրախ և Coronavirus RTC-ի գործընկեր.
NiRAN տիրույթն ունի երեք հաջորդականության մոտիվներ (AN, BN և CN), որոնք պարունակում են շատ փոքր թվով մնացորդներ, որոնք պահպանված են բոլոր ընտանիքներում մոնոֆիլետիկ, բայց խիստ տարբերակված Nidovirales կարգով (8, 16):Վերջին ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ դրանք կառուցվածքային առումով կապված են սպիտակուցի կինազանման սպիտակուցների հիմնականում չբնութագրված ընտանիքի հետ, որոնք ի սկզբանե կոչվում էին SelO ընտանիք (17, 19, 22, 30, 31):SelO-ի հետ կապված սպիտակուցներն ունեն կինազային ծալքեր, սակայն դասական կինազներում չունեն մի քանի պահպանված ակտիվ տեղամասի մնացորդներ (22, 32):Հիմք ընդունելով ATP-ի մոլեկուլների հակառակ կողմնորոշումը, կապված ակտիվ վայրում և կայունացել է հատուկ փոխազդեցությունների միջոցով, ենթադրվեց, որ SelO-ն ենթադրեց, և այնուհետև հաստատվեց, որ AMP-ը (ֆոսֆատի փոխարեն) տեղափոխում է սպիտակուցի սուբստրատ (22), մինչդեռ մեկ այլ բակտերիալ SelO-նման պրոտեին YdiU ունի: Վերջերս ցուցադրվել է, որ կատալիզացնում է UMP-ի կովալենտային կցումը Tyr-ին և տարբեր սպիտակուցային սուբստրատների Նրա մնացորդներին (33):
Կորոնավիրուսի NiRAN տիրույթի ենթադրյալ ակտիվ տեղամասի մնացորդների կանխատեսումը հաստատելու և ընդլայնելու համար մենք օգտագործեցինք կենսաքիմիական և հակադարձ գենետիկական մեթոդներ՝ մուտացիոն վերլուծություն կատարելու համար nsp12 կորոնավիրուսի վրա (Նկար 3D և E և SI հավելված, Նկար S3 և աղյուսակ) S1â: S4):Տվյալները ցույց են տալիս, որ HCoV-229E K4135, R4178 և D4280-ի փոխարինումը Ala-ով վերացնում է in vitro NMP տրանսֆերազայի ակտիվությունը և վիրուսի վերարտադրությունը բջջային կուլտուրայում (Նկար 3D և E և SI հավելվածներ, Նկար S3)՝ աջակցելով դրանց ներկայությանը NTP γ-ֆոսֆատում: (K4135, R4178) և ակտիվ տեղանքի մետաղական իոնների համակարգումը (D4280):Պահպանված Glu-ի E4145A փոխարինումը թռչնի բնի վիրուսի միջակայքում, որը կանխատեսվում էր, որ կկայունացնի K4135 (17) դիրքը, ցույց է տրվել, որ վերացնում է վիրուսի վերարտադրությունը, բայց զարմանալիորեն ակտիվությունը պահպանվել է in vitro NMPylation վերլուծության մեջ (Նկար 3D և E և SI հավելված, Նկար S3 և աղյուսակներ S1–S4):Նմանատիպ դիտարկում է արվել, երբ համապատասխան փոխարինումը ներդրվել է Salmonella typhimurium-ի (E130A) YdiU հոմոլոգում (33):Այս տվյալները միասին վերցրած աջակցում են այս պահպանված մնացորդի կարգավորիչ գործառույթին, այլ ոչ թե կատալիտիկ ֆունկցիային:
Պահպանված Phe մնացորդի (F4281A) փոխարինումը նեստովիրուսի միջակայքում HCoV-229E NiRAN տիրույթում (8) հանգեցրեց NMPylation-ի ակտիվության նվազմանը in vitro և վիրուսի վերարտադրության զգալի նվազմանը բջիջների մշակույթում (Նկար 3D, E և SI) հավելված, Նկար S3):Տվյալները համապատասխանում են այս մնացորդի կարևոր կարգավորիչ ֆունկցիային, ինչպիսին է նախկինում ցուցադրված հոմոլոգ DFG մոտիվը Phe մնացորդը:Դասական պրոտեին կինազներում այն Mg2+ կապող օղակի մի մասն է և օգնում է հավաքել և կարգավորել ողնաշարը:??Պահանջվում է արդյունավետ կատալիտիկ գործունեության համար (32, 34):K4116 մնացորդներով Ala-ի և Arg-ի փոխարինումը (preAN մոտիվով), համապատասխանաբար, վերացրեց վիրուսի վերարտադրությունը և, ինչպես և սպասվում էր, տարբեր ազդեցություններ ունեցավ NMP տրանսֆերազայի ակտիվության վրա in vitro՝ կախված ներդրված ամինաթթուների կողային շղթայից (Նկար 3D And E և SI հավելվածներ: , Նկար S3):Ֆունկցիոնալ տվյալները համապատասխանում են կառուցվածքային տեղեկատվությանը, ինչը ցույց է տալիս, որ այս մնացորդը փոխազդեցություն է հաստատել ATP ֆոսֆատի հետ (17):Այլ ներդիր վիրուսային ընտանիքների NiRAN տիրույթում HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116-ի դիրքը զբաղեցնում է Lys, Arg կամ His (8), ինչը ցույց է տալիս, որ այս հատուկ մնացորդի ֆունկցիոնալ սահմանափակումը թուլացել է:D4188A-ի և D4283A-ի փոխարինումը վերացնում կամ խիստ նվազեցնում է ֆերմենտի ակտիվությունը և վերացնում վիրուսի վերարտադրությունը (Նկար 3):Այս երկու մնացորդները պահպանված են շատ (բայց ոչ բոլոր) ներդիր վիրուսների մեջ (8), ինչը ցույց է տալիս կարևոր ընտանիքին հատուկ, բայց, հնարավոր է, ոչ կատալիտիկ ֆունկցիա:Որպես վերահսկողություն օգտագործվել են մի քանի այլ Lys և Asp մնացորդների Ala փոխարինումներ (K4113A, D4180A, D4197A և D4273A), որոնք պահպանված չեն Coronaviridae կամ այլ Nestioviridae ընտանիքներում (8):Ինչպես և սպասվում էր, այս փոխարինումները մեծ մասամբ տանելի են՝ ֆերմենտային ակտիվության և որոշ դեպքերում վիրուսի վերարտադրության մի փոքր նվազումով (Նկար 3 և SI հավելված, Նկար S3):Ընդհանուր առմամբ, կորոնավիրուսի մուտագենեզի տվյալները շատ համահունչ են EAV NiRAN-RdRp (16) ինքնակառավարման GMP-ի և հակադարձ գենետիկական տվյալների հետ, որոնցում EAV nsp9 (կորոնավիրուսի nsp12 օրթոլոգ) մնացորդը K94 (համապատասխանում է HCoV-229E K4135-ին) կարևոր գործառույթ է, R124 (համապատասխանում է R4178-ին), D132 (համապատասխանում է D4188-ին), D165 (համապատասխանում է D4280-ին), F166 (համապատասխանում է F4281-ին):Բացի այդ, HCoV-229E մուտագենեզի տվյալները համահունչ և ընդլայնված են նախկինում հաղորդված SARS-CoV-ի հակադարձ գենետիկական տվյալներին (16), նույնքան նման են համապատասխան CN-ի համապատասխան մոտիվի՝ Phe-to-Ala մուտանտի SARS-CoV_nsp12 The-ի նկատվածներին: նկարագրված ֆենոտիպը -F219A և HCoV-229E_F4281A (Նկար 3 D և E և SI հավելված, Նկար S3 և Աղյուսակ S1-S4):
Համեմատած EAV օրթոլոգների (16) հետ, որոնք հստակ նախապատվություն ունեն UTP-ին և GTP-ին (ինքնա-NMPylation ռեակցիայի մեջ), մեր ուսումնասիրությունը ցույց է տալիս, որ կորոնավիրուսային NiRAN տիրույթը (ներկայացված HCoV-229E-ով և SARS-CoV-2-ով) կարող է արդյունավետ լինել: փոխանցված բոլոր չորս NMP-ները, թեև UMP-ի համար մի փոքր նախապատվություն կա (Նկար 1 և 3):Հատուկ NTP համասուբստրատի համեմատաբար ցածր սպեցիֆիկությունը համապատասխանում է վերջերս հաղորդված SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 սուպերկոմպոզիտային կառուցվածքին, որտեղ ADP-Mg2+-ը կապվում է NiRAN-ի ակտիվ տեղամասին, բայց ոչ ադենինային մասի հետ: կոնկրետ փոխազդեցությունների ձևավորման մասին (17):Մեր ուսումնասիրության մեջ NMPylation ռեակցիայի մեջ օգտագործվող նուկլեոտիդի տեսակը չունի դիֆերենցիալ ազդեցություն մուտանտի սպիտակուցի ակտիվության վրա (SI Հավելված, Նկար S3), ինչը ցույց է տալիս, որ այս մնացորդներից և ոչ մեկը սերտորեն կապված չէ հատուկ նուկլեոբազայի միացման հետ:Կորոնավիրուսների և զարկերակային վիրուսների NiRAN տիրույթներում նկատված NTP համահունասուբստրատի տարբեր նախապատվությունների կառուցվածքային հիմքը և հնարավոր կենսաբանական նշանակությունը դեռ պետք է ուսումնասիրվեն.դրանք կարող են ճշմարիտ լինել կամ պայմանավորված լինել իրենց համապատասխան ուսումնասիրությունների սահմանափակումներով:Ներկայում չի կարելի բացառել, որ զարկերակային վիրուսի NiRAN տիրույթի պոտենցիալ NMPylator ակտիվությունը (համեմատած նախկինում բնութագրված ինքնա-NMPylation ակտիվության հետ) ունի այլ համասուբստրատային նախապատվություն՝ հաշվի առնելով, որ նմանությունը զարկերակի և կորոնավիրուսի միջև։ NiRAN տիրույթն իր սահմանաչափի վրա է:Հաջորդականության վրա հիմնված Համեմատեք (16).Համեմատած պսևդոկինազի SelO-ի հետ, որն օգտագործում է Mg2+ որպես կոֆակտոր, կորոնավիրուսի և զարկերակային վիրուսի NiRAN-ի ակտիվությունը կախված է Mn2+-ից (16) (Նկար 3C և SI հավելված, Նկար S1):Mn2+ կախվածությունը և UTP-ի ակնհայտ նախապատվությունը սպիտակուցային NMPylators-ի անսովոր հատկանիշն է և միայն վերջերս է հաստատվել Salmonella typhimurium-ի YdiU սպիտակուցում, որը կատալիզացնում է խիստ Mn2+-ից կախված սպիտակուցային շապերոնային UMPylation՝ պաշտպանելու բջիջները սթրեսի ինդուկցիայի Բջջային ATP լողավազանից: 33):
Կորոնավիրուսի NiRAN տիրույթի և բջջային պրոտեին կինազների (17, 19) միջև վերջերս նկարագրված կառուցվածքային նմանությունը լրացուցիչ աջակցություն է տրամադրում NiRAN-ի՝ NMP-ը կովալենտորեն կապելու այլ սպիտակուցների հետ, որոնք մենք հայտնել ենք այս ուսումնասիրության մեջ:Մենք կենտրոնացրինք մեր որոնումը NiRAN-ի հնարավոր թիրախների վրա HCoV-229E ORF1a-ով կոդավորված սպիտակուցների վրա, որոնք, ինչպես հայտնի է, ուղղակիորեն կամ անուղղակիորեն օգնում են RTC-ի ORF1b-ով կոդավորված կրկնօրինակմանը (12, 35):Մեր փորձերը վերջնական ապացույցներ են տալիս nsp9-ի արդյունավետ և հատուկ NMPylation-ի համար (Նկար 2):Եթե թիրախային սպիտակուցը օգտագործվում է մոլային ավելցուկով, որը 8-ից 10 անգամ ավելի բարձր է, քան ֆերմենտի (nsp12), ապա հաստատվում է, որ nsp9-ն ամբողջությամբ (մոնո)NMPացված է (Նկար 4):Մենք եզրակացրինք, որ nsp12-ի և nsp9-ի փոխազդեցությունը կարճատև է և կայուն բարդույթ չի ձևավորի nsp9-ի հետ (այլ RTC ստորաբաժանումների բացակայության դեպքում):Այս եզրակացությունը հաստատվում է SARS-CoV պրոտեոմի վրա սպիտակուցների փոխազդեցության ուսումնասիրություններով (35):MS վերլուծությունը բացահայտեց nsp9-ի N-տերմինալ մնացորդի առաջնային ամինը որպես NMPylation տեղ (SI հավելված, Նկար S5):Ֆոսֆորամիդային կապի և N-տերմինալ ամինո խմբի ձևավորումը տարբերում է NiRAN-ով միջնորդավորված NMPylation ակտիվությունը Pseudomonas syringae SelO-միջնորդված ԱՄՓիլացման ռեակցիայից, որը կատալիզացնում է O-կապակցված AMP-ի ձևավորումը Ser, Thr կամ Tyr մնացորդների պեպտիդային հավելումներում ( 22), իսկ S. typhimurium YdiU-ն ձևավորում է O-կապակցված (Tyr-ի հետ) և N-կապակցված (His-ի հետ) պեպտիդ-UMP հավելումներ:SelO սպիտակուցների ընտանիքի մասին հասանելի սահմանափակ տեղեկատվությունը ցույց է տալիս, որ այս մեծ սպիտակուցային ընտանիքի անդամները մեծապես տարբերվում են պեպտիդ-NMP հավելումների ձևավորման հարցում:Սա հետաքրքիր դիտարկում է, որն արժանի է հետագա ուսումնասիրության։
Այս ուսումնասիրության արդյունքում ստացված տվյալները մեզ հանգեցրին այն վարկածին, որ nsp9-ի NMPylation-ը պահանջում է ազատ N-վերջ:Վիրուսային վերարտադրության համատեքստում դա կտրամադրվի nsp8|nsp9 մշակման տեղամասի պրոտեոլիտիկ ճեղքման միջոցով ռեպլիկազային պոլիպրոտեին pp1a-ում միջնորդավորված Mpro-ի և pp1ab-ի կողմից:Կորոնավիրուսների մեծ մասում այս հատուկ տեղամասի (VKLQ|NNEI HCoV-229E-ում) և բոլոր մյուս կորոնավիրուսային Mpro ճեղքման վայրերի միջև տարբերությունը Asn-ն է (այլ ոչ թե մեկ այլ փոքր մնացորդ, ինչպիսիք են Ala, Ser կամ Gly) զբաղեցնում են P1â-ը:??Գտնվելու վայրը (36).Վաղ ուսումնասիրություններում ձեռք բերված պեպտիդների տրոհման տվյալները ցույց են տվել, որ nsp8|nsp9 տեղամասի տրոհման արդյունավետությունը ավելի ցածր է, քան մյուս տեղամասերը, ինչը ցույց է տալիս, որ 1) այս հատուկ տեղամասը կարող է կարգավորիչ դեր ունենալ C-տերմինալի ժամանակին համակարգված մշակման մեջ: pp1a շրջան, կամ 2) ա Հատուկ պահպանված nsp9 N-վերջնակի դերը վիրուսի վերարտադրության մեջ (37):Մեր տվյալները (Նկար 5Ա) ցույց են տվել, որ իրական N-տերմինալ հաջորդականությունը կրող nsp9-ի ռեկոմբինանտ ձևը արդյունավետորեն NMPացվել է nsp12-ով:N-տերմինալի եզրային հաջորդականությունը հեռացվել է Xa գործոնով (nsp9-His6; SI հավելված, Աղյուսակ S1) կամ Mpro միջնորդավորված կտրվածքով (nsp7-11-His6; Նկար 5A և SI հավելված, Աղյուսակ S1):Կարևոր է, որ չկտրված nsp9 պարունակող nsp7-11-His6 պրեկուրսորը ցույց է տվել դիմադրություն nsp12-ի NMPylation-ի նկատմամբ, ինչը համահունչ է մեր տվյալներին, ինչը ցույց է տալիս, որ nsp9-NMP հավելումը ձևավորվում է N-տերմինալ առաջնային ամինի միջոցով (SI հավելված, Նկար S5) .NiRAN-ի սուբստրատի առանձնահատկությունն ավելի խորը հասկանալու համար մենք կենտրոնացանք nsp9-ի հարակից N-տերմինալ մնացորդների վրա:Այլ սպիտակուցների բացակայության դեպքում դրանք կառուցվածքային առումով ճկուն են՝ թույլ չտալով, որ դրանք հայտնաբերվեն nsp9-ի չպիտակավորված ձևով (26 28, 38), ինչը ցույց է տալիս դրանց սահմանափակ բնական տատանումները: Սա պայմանավորված է կարևոր հաջորդականությամբ հատուկ (կապված չէ երկրորդական կառուցվածքով) nsp9 N-տերմինալ հատվածի գործառույթը:Այս տարածաշրջանում պահպանված մնացորդների Ala փոխարինումները (Նկարներ 5C և D և SI հավելված, Նկար S8) ցույց են տալիս, որ N3826-ը կարևոր է nsp9 NMPylation in vitro-ում, մինչդեռ N3825A և E3827A փոխարինումները հանգեցնում են NMPylation-ի նվազմանը, մինչդեռ M3829A-ի և P38-ի փոխարինումները չեն նվազում: .Ակնհայտորեն ազդում է nsp9 NMPylation-ի վրա:Չնայած N-տերմինալ Asn-ի փոխարինումը (N3825A, N3825S) ունի միայն չափավոր ազդեցություն nsp9 NMPylation-ի և վիրուսի վերարտադրության վրա բջջային մշակույթում (Նկար 5C և D), Asn-ի մնացորդային հաջորդականության ջնջումը N-տերմինալ 3825-NN դիպեպտիդից: Ապացուցված է, որ այն մահացու է վիրուսների համար, ինչը ցույց է տալիս, որ մեկ Asn մնացորդ է պահանջվում N-վերջում մեկ այլ մնացորդից առաջ, նախընտրելի է Asn-ը, չնայած թվում է, որ նմանատիպ մնացորդների փոխարինումը կարող է մասամբ հանդուրժվել (Նկար 5B, C և D):Մենք եզրակացնում ենք, որ 3825-NN դիպեպտիդը, հատկապես պահպանված և էական N3826 մնացորդը կորոնավիրուսի տիրույթում (SI հավելված, Նկար S6), ապահովում է nsp9 N-վերջնակի ճիշտ կապը և կողմնորոշումը NiRAN-ի ակտիվ վայրում:
Ալան (E3827A) փոխարինելով բոլոր ենթաընտանիքների պահպանված Glu-ին, պահպանում է nsp9 NMPylation in vitro, բայց մահացու է բջիջների կուլտուրայում վիրուսների համար (Նկար 5C և D), ինչը ցույց է տալիս այս մնացորդի լրացուցիչ գործառույթը, օրինակ՝ առանցքային փոխազդեցություններում (NMPylated կամ unmodified): ) nsp9 N-տերմինալ և այլ գործոններ, որոնք ներգրավված են վիրուսի վերարտադրության մեջ:Nsp9 մուտացիաները չեն ազդել nsp9-ի կամ որևէ հարակից nsps-ի պրոտեոլիտիկ գործընթացի վրա (39) (SI Հավելված, Նկար S9), ինչը ցույց է տալիս, որ մի քանի nsp9 մուտացիաների մահացու ֆենոտիպերը չեն առաջացել C պրոտեոլիտիկ գործընթաց-տերմինալ pp1a տարածքի դիսկարգավորմամբ: .
Վերոնշյալ տվյալները վկայում են այն մասին, որ pp1a/pp1ab-ում nsp8|9 տրոհման տեղամասի Mpro միջնորդավորված բուժումից հետո nsp9-ի N-վերջը կարող է UMPylated (կամ մասամբ փոփոխվել մեկ այլ NMP-ով):Բացի այդ, nsp9-ի N-վերջնականի գերազանց պահպանումը (ներառյալ եզակի և անփոփոխ Asn մնացորդները կորոնավիրուսների ընտանիքում) և այս ուսումնասիրության արդյունքում ստացված հակադարձ գենետիկական տվյալները (Նկարներ 3E և 5D) հանգեցրել են մեզ եզրակացության, որ նկարագրված nsp9 NMPylation կենսաբանորեն կապված է և կարևոր է կորոնավիրուսի վերարտադրության համար։Այս փոփոխության ֆունկցիոնալ հետևանքները դեռ պետք է ուսումնասիրվեն, օրինակ՝ կապված նախկինում նկարագրված (ոչ սպեցիֆիկ) nsp9 (չփոփոխված ձև) ՌՆԹ կապող ակտիվության հետ (2628):N-տերմինալ NMPylation-ը կարող է նաև ազդել nsp9-ի փոխազդեցության վրա սպիտակուցի կամ ՌՆԹ-ի սուբստրատների հետ կամ տարբեր չորս մակարդակի հավաքների ձևավորման վրա:Դրանք նկատվել են կառուցվածքային ուսումնասիրություններում և հաստատվել են, որ ֆունկցիոնալորեն կապված են կորոնավիրուսի վերարտադրության հետ, թեև հատկապես այս փոփոխության դեպքում (26- â29, 40) բացակայության դեպքում:
Թեև NiRAN տիրույթի թիրախային առանձնահատկությունը դեռ պետք է ավելի մանրամասն նկարագրվի, մեր տվյալները ցույց են տալիս, որ NiRAN տիրույթի սպիտակուցի թիրախային առանձնահատկությունը շատ նեղ է:Թեև բոլոր նիդովիրուսների ընտանիքների NiRAN տիրույթում հիմնական ակտիվ մնացորդների պահպանումը (8, 16) մեծապես աջակցում է այս սպիտակուցների պահպանված NMPylator-ի ակտիվությանը, այս տիրույթի ենթաշերտը կապող գրպանի մնացորդների ինքնությունը պահպանումը և պահպանումը դեռ պետք է բնութագրվեն: , և կարող է տարբերվել Nidovirales-ի տարբեր ընտանիքների միջև:Նմանապես, այլ ներդիր վիրուսների համապատասխան թիրախները դեռ պետք է որոշվեն:Դրանք կարող են լինել nsp9-ի կամ այլ սպիտակուցների հեռավոր օրթոլոգներ, քանի որ հինգ կրկնօրինակ տիրույթներից դուրս գտնվող հաջորդականությունները, որոնք սովորաբար պահպանվում են բնադրված վիրուսներում, ավելի քիչ պահպանված են (8), ներառյալ գենոմային զանգվածը Mpro-ի և NiRAN-ի միջև: Նրանց թվում, nsp9-ը գտնվում է կորոնավիրուս.
Բացի այդ, մենք ներկայումս չենք կարող բացառել, որ NiRAN տիրույթն ունի լրացուցիչ (ներառյալ բջջային) թիրախներ:Այս դեպքում հարկ է նշել, որ այս առաջացող սպիտակուցային NMPylators (NMPylators) (30, 31) բակտերիալ հոմոլոգները կարծես թե ունեն «գլխավոր կարգավորիչներ»:NMP-ը մոդուլավորում է մի շարք բջջային սպիտակուցներ՝ կարգավորելու կամ վերացնելու դրանց ներքևի գործունեությունը, դրանով իսկ դեր խաղալով մի շարք կենսաբանական գործընթացներում, ինչպիսիք են բջջային սթրեսի արձագանքը և ռեդոքս հոմեոստազը (22, 33):
Այս ուսումնասիրության մեջ (Նկարներ 2 և 4 և SI Հավելված, Նկարներ S3 և S5), մենք կարողացանք ապացուցել, որ nsp12-ը փոխանցել է UMP (NMP) մասը nsp9-ում մեկ (պահպանված) դիրքի, մինչդեռ մյուս սպիտակուցները չեն փոփոխվել օգտագործվում է Պայմաններում լավ սահմանված (այլ ոչ թե չամրացված) ենթաշերտի առանձնահատկությունն ապահովված է:Դրան համահունչ, համեմատած N-տերմինալ nsp9 NMPylation-ի հետ, nsp12-ի սեփական NMPylation ակտիվությունը շատ ցածր է, դրա հայտնաբերումը պահանջում է ավելի երկար ավտոռադիոգրաֆիկ ազդեցության ժամանակ, և օգտագործվում է nsp12 կոնցենտրացիայի 10 անգամ ավելացում:Բացի այդ, մեր MS վերլուծությունը չկարողացավ ապացույցներ տրամադրել nsp12-ի NMPylation-ի համար, ինչը ենթադրում է, որ NiRAN տիրույթի ինքնա-NMPylation-ը (լավագույն դեպքում) երկրորդական գործունեություն է:Այնուամենայնիվ, հարկ է նշել, որ այլ ուսումնասիրություններ նախնական ապացույցներ են տվել, որ բակտերիալ NMPylator-ի ինքնա-AMPylation կարգավիճակը կարող է վերահսկել նրանց NMPylation գործունեությունը այլ սպիտակուցային սուբստրատների վրա (22, 33):Հետևաբար, ավելի շատ հետազոտություններ են անհրաժեշտ՝ ուսումնասիրելու EAV nsp9 (16) և կորոնավիրուսային nsp12 (այս ուսումնասիրություն) համար հաղորդված ինքնա-NMPylation գործողությունների հնարավոր ֆունկցիոնալ ազդեցությունները, ներառյալ առաջարկվող շապերոնանման ազդեցությունը C-տերմինալ RdRp տիրույթի ծալման վրա ( 16)):
Նախկինում դիտարկվել են մի քանի վարկածներ՝ կապված nidoviral NiRAN տիրույթի հնարավոր ներքևի ֆունկցիաների հետ, ներառյալ ՌՆԹ լիգազան, ՌՆԹ-ով ծածկված գուանիլատ տրանսֆերազը և սպիտակուցի պրիմինգային ակտիվությունը (16), բայց դրանցից ոչ մեկը համատեղելի չէ հասանելի ներքևի ֆունկցիաների հետ:Հետևյալ դիրքերում ստացված տեղեկատվությունը ճիշտ նույն ժամանակն է՝ առանց լրացուցիչ ենթադրություններ անելու.Այս ուսումնասիրության արդյունքում ստացված տվյալները առավել համահունչ են (բայց չեն կարող ապացուցել), որ NiRAN տիրույթը ներգրավված է սպիտակուցի կողմից առաջացած ՌՆԹ սինթեզի մեկնարկի մեջ:Նախկինում ենթադրվում էր, որ NiRAN տիրույթի գործառույթը 5??²-ՌՆԹ-ի ծածկույթը կամ ՌՆԹ-ի կապակցման ռեակցիաները չեն ազդում այս և այլ տվյալների վրա:Հետևաբար, օրինակ, համարվում է, որ NiRAN-ի ակտիվ տեղամասը ներառում է պահպանված Asp-ը որպես ընդհանուր հիմք (D252 Pseudomonas syringae SelO-ում; D4271՝ HCoV-229E pp1ab; D208՝ SARS-CoV-2 nsp12-ում) (SI Հավելված, նկար 2): )S2) (17, 22, 33), մինչդեռ ATP-կախյալ ՌՆԹ-ի լիգազում և ՌՆԹ-ի ծածկող ֆերմենտում կատալիզն իրականացվում է կովալենտային ֆերմենտ-(լիզիլ-N)-NMP միջանկյալ նյութով, որը ներառում է չփոփոխված Lys մնացորդ ( 41):Բացի այդ, NiRAN կորոնավիրուսի հաջորդականության վրա հիմնված ուշագրավ յուրահատկությունը պահպանված սպիտակուցային թիրախների համար և հանգստացած յուրահատկությունը NTP համասուբստրատների համար (նախընտրում է UTP) հակադրվում է NiRAN-ով միջնորդավորված ծածկող ֆերմենտի կամ ՌՆԹ լիգազանման գործառույթներին:
Ակնհայտ է, որ շատ լրացուցիչ աշխատանք է անհրաժեշտ՝ ստուգելու և, եթե ապացուցվի, մանրամասնելու nsp9-UMP-ի (nsp9-NMP) հնարավոր դերը սպիտակուցներով առաջացած ՌՆԹ-ի սինթեզում, որը կմիացնի մի քանի հետաքրքիր, բայց (առայժմ) նախկինում հաղորդված զեկույցներ: .Մեկուսացված դիտարկումներ.Օրինակ՝ պարզվել է, որ կորոնավիրուսի բացասական շղթայի ՌՆԹ-ի վերջը սկսվում է օլիգո(U) շղթայով (42, 43):Այս դիտարկումը համահունչ է այն մտքին, որ բացասական շղթայով ՌՆԹ-ի սինթեզը սկսվում է nsp9-ի UMPylated ձևը պոլի(A) պոչին (գործարկիչներ) կապելու միջոցով, ինչը կարող է խթանվել ՌՆԹ-ի կապակցման միջոցով: Գործողությունը և/կամ փոխազդեցությունը հետ մեկ այլ RTC սպիտակուց:Այնուհետև nsp9-ով տրամադրված UMP մասը կարող է օգտագործվել որպես «պրիմեր» nsp7/8/nsp12 միջնորդավորված օլիգուրիդիլացման համար՝ օգտագործելով 3??²-պոլի (A) պոչը գենոմային ՌՆԹ-ում կամ մեկ այլ օլիգո (A) պարունակող հաջորդականություն: ծառայում է որպես ձևանմուշ, որը նման է պիկորնավիրուսի VPg սպիտակուցի համար հաստատված մեխանիզմին (44):Իսկ եթե առաջարկը «ոչ նորմատիվ» է:???Բացասական շղթայի ՌՆԹ-ի (սպիտակուց առաջացած) սինթեզի սկիզբը կապ է ապահովում դիտարկումների հետ՝ ցույց տալով, որ կորոնավիրուսի բացասական շղթայի ՌՆԹ-ն ունի UMP (UTP-ի փոխարեն) իր վերջում (42), որը համարվում է, որ ցույց է տալիս, որ նուկլեինաթթու Dicer-ը կտրում է ուրիդին հատուկ էնդոնուկլեազի կողմից ֆոսֆորիլացված ծայրը:Եթե հաստատվի, այս նուկլեինաթթվի հիդրոլիտիկ ակտիվությունը կարող է օգնել ազատել nsp9-ի օլիգոմերային UMPylated ձևը նորածին բացասական շղթայի 5 ² ծայրից:nsp9-ի հնարավոր դերը սպիտակուցի պրիմինգում համահունչ է նաև նախորդ հակադարձ գենետիկայի ուսումնասիրություններին, որոնք ցույց են տվել, որ nsp9 (և nsp8) փոխազդում են խիստ և հատուկ կոնսերվացված cis գործող ՌՆԹ տարրի հետ՝ կորոնավիրուսի գենոմի 3-րդ ծայրի մոտ:45):Համաձայն այս զեկույցի՝ այս նախկին դիտարկումներն այժմ կարող են վերաքննվել և ընդլայնվել հետագա հետազոտությունների միջոցով:
Ամփոփելով, մեր տվյալները որոշեցին հատուկ ներդիր վիրուսի ֆերմենտի հատկորոշիչի հատուկ ակտիվությունը, որը կապված է RdRp-ի հետ N-վերնամասում:Կորոնավիրուսի դեպքում այս նոր հայտնաբերված NiRAN-ի միջնորդությամբ UMPylator/NMPylator գործունեությունը օգտագործվում է Mn2+-ի և հարակից Asn մնացորդների վրա հիմնվելու և N-տերմինալ առաջնային ամինի հետ (ցածր էներգիայի) ֆոսֆորամիդային կապերի ձևավորման պատճառ դառնալու համար:Mpro միջնորդավորված ճեղքման միջոցով nsp8|9 ճեղքման վայրում, nsp9 թիրախը կարող է օգտագործվել NMPylation-ի համար՝ ցույց տալով պրոթեզերոնի և NiRAN տիրույթի ֆունկցիոնալ զուգավորումը, որը տարածվում է մինչև RdRp:Հիմնական մնացորդների պահպանումը nsp12 NiRAN ակտիվ վայրում և nsp9 թիրախում, զուգակցված երկու կորոնավիրուսներից, ներառյալ SARS-CoV-2-ից ստացված տվյալների հետ, ամուր ապացույց է այն բանի, որ nsp9 NMPylation-ը կորոնավիրուս է Պահպանողական առանձնահատկությունները նաև վիրուսի վերարտադրության հիմնական քայլն են:Առկա տվյալները մեզ թույլ են տալիս եզրակացնել, որ nsp9-ի NMPylated ձևի հատուկ դերը սպիտակուցներով պայմանավորված ՌՆԹ-ի սինթեզում ողջամիտ սցենար է կորոնավիրուսի և այլ ներդիր վիրուսների համար, և NiRAN-ը կարող է նաև թիրախավորել այլ չբացահայտված սպիտակուցներ:Կարգավորել վիրուսը.Հյուրընկալողի փոխազդեցություն:Եթե հաստատվի, ապա վիրուսային ՌՆԹ-ի սինթեզում սպիտակուցային պրայմերների ներգրավումը կբարձրացնի Mpro/3CLpro և RdRp տիրույթների հաջորդականությունը նախկինում հայտնաբերված կորոնավիրուսի և պիկորնավիրուսի նման սուպերխմբի միջև (9), որոնք այժմ միավորվել են վերջերս ստեղծված Pisonivirites-ում ( 46) անվանակարգում.
Մեր տվյալները նաև ցույց են տալիս, որ այս հետազոտության մեջ հայտնաբերված հիմնական, ընտրողական և պահպանողական ֆերմենտային գործունեությունը կարող է օգտագործվել որպես հակավիրուսային դեղամիջոցների թիրախ:Միացությունները, որոնք խանգարում են NiRAN-ի ակտիվ վայրում պահպանված nsp9 N-տերմինալի կապակցմանը (և հետագա ձևափոխմանը), կարող են վերածվել արդյունավետ և բազմակողմանի հակավիրուսային դեղամիջոցների, որոնք հարմար են տարբեր (ենթա)սեռի վարակների կենդանիների և մարդկանց կորոնավիրուսների բուժման համար: ներառյալ SARS-CoV-2-ը և Մերձավոր Արևելքի շնչառական համախտանիշի կորոնավիրուսը։
Այս հետազոտության ընթացքում արտադրված կորոնավիրուսային սպիտակուցի կոդավորող հաջորդականությունը ուժեղացվել է RT-PCR-ով, օգտագործելով ՌՆԹ-ն՝ մեկուսացված Huh-7-ից՝ վարակված HCoV-229E-ով կամ Vero E6-ով, որը վարակված է SARS-CoV-2-ով, և տեղադրվել է ստանդարտ կլոնավորման ընթացակարգերի միջոցով:pMAL-c2 (Նյու Անգլիայի կենսաբանական լաբորատորիա) կամ pASK3-Ub-CHis6 (47) արտահայտման վեկտոր (SI Հավելված, Աղյուսակներ S1 և S2):Մեկ կոդոնի փոխարինումները ներդրվել են PCR-ի վրա հիմնված տեղային ուղղորդված մուտագենեզով (48):MBP միաձուլման սպիտակուցը արտադրելու համար E. coli TB1 բջիջները փոխակերպվել են համապատասխան pMAL-c2 պլազմիդային կառուցվածքով (SI հավելված, Աղյուսակ S1):Միաձուլման սպիտակուցը մաքրվել է ամիլոզի մերձավորության քրոմատագրմամբ և բաժանվել Xa գործոնով:Այնուհետև, C-տերմինալի His6 պիտակավորված սպիտակուցը մաքրվել է Ni-անշարժացված մետաղի մերձեցման քրոմատագրմամբ (Ni-IMAC), ինչպես նախկինում նկարագրված է (49):Ubiquitin-ի միաձուլման սպիտակուցը արտադրելու համար E. coli TB1 բջիջներն օգտագործել են համապատասխան pASK3-Ub-CHis6 պլազմիդային կոնստրուկցիան (SI Հավելված, Աղյուսակներ S1 և S2) և pCGI պլազմիդի ԴՆԹ-ն, որը կոդավորում է ուբիկվիտինին հատուկ C-տերմինալ հիդրոլազա 1 (Ubp1):Փոխակերպում (47).C-տերմինալ His6-ով պիտակավորված կորոնավիրուսային սպիտակուցը մաքրվել է ինչպես նախկինում նկարագրված (50):
HCoV-229E nsp12-His6-ի ինքնա-NMPylation թեստը կատարվել է, ինչպես նկարագրված է EAV nsp9-ում (16):Մի խոսքով, nsp12-His6 (0,5 մկՄ) պարունակում է 50 մՄ 4-(2-հիդրօքսիէթիլ)-1-պիպերազինէթանասուլֆոնիկ թթու (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 մՄ դիթիոթրեյտոլ (DTT), 6 մՄ MnCl2, 25 մկմ բուֆեր: նշված NTP-ը և 0,17 μM-ը համընկնում են [α32-P]NTP (3000 Ci/մմոլ; Hartmann Analytic) 30 °C ջերմաստիճանում 30 րոպեի ընթացքում:nsp12-ով միջնորդավորված nsp9 NMPylation-ի մյուս (ստանդարտ) NMPylation փորձարկումներում ռեակցիայի պայմանները ճշգրտվում են հետևյալ կերպ. ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 μM նշված NTP և 0.17 μM համընկնող [α32-P]NTP:10 րոպե 30°C-ում ինկուբացիայից հետո ռեակցիայի նմուշը խառնվել է SDS-PAGE նմուշի բուֆերի հետ՝ 62,5 մՄ տրիս(հիդրօքսիմեթիլ)ամինոմեթան HCl (pH 6,8), 100 մՄ DTT, 2,5% SDS, 10% գլիցերին և 0,0005% բրոմպենոլ: Կապույտ.Սպիտակուցը 5 րոպե տաքացնելով 90 °C-ում և անջատվել է 12% SDS-PAGE-ով:Գելը ամրացվում և ներկվում է Coomassie Brilliant Blue լուծույթով (40% մեթանոլ, 10% քացախաթթու, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250), գունազերծվում և 20 ժամով ենթարկվում է ֆոսֆորեսցենտային պատկերի էկրանին (nsp12-ը NMPylation-ից հայտնաբերելու համար): կամ (առավելագույնը) 2 ժամ (nsp9 NMPylation գնահատելու համար):Էկրանի սկանավորման համար օգտագործվել է Typhoon 9200 պատկերիչ (GE Healthcare), իսկ ազդանշանի ինտենսիվությունը վերլուծելու համար՝ ImageJ:
MS վերլուծության համար 1 μM nsp12-His6 և 10 μM nsp9 (առանց հեքսահիստիդինի պիտակի) օգտագործվել են NMPylation վերլուծության մեջ (SI հավելված, Աղյուսակ S1) և օգտագործվել է 500 μM UTP և GTP ավելացված կոնցենտրացիան:Կախված դրանց կոնցենտրացիայից և սպիտակուցի ակնկալվող որակից՝ Waters ACQUITY H դասի HPLC համակարգն օգտագործվել է MassPrep սյունակով (Waters)՝ 1-ից 10 մկլ բուֆերացված սպիտակուցային լուծույթների առցանց աղազերծման համար:Աղազերծված սպիտակուցը զտվում է Synapt G2Si զանգվածային սպեկտրոմետրի (Ջրեր) էլեկտրասփրեյ իոնային աղբյուրի մեջ բուֆեր A (ջուր/0,05% մրջնաթթու) և բուֆեր B (ացետոնիտրիլ/0,045% մածուցիկ թթու) հետևյալ գրադիենտով, իսկ սյունակի ջերմաստիճանը կազմում է. 60 ° C և հոսքի արագություն 0,1 մլ/րոպե. 2 րոպե 5% A իզոկրատական եղանակով լուծարում, այնուհետև 8 րոպեի ընթացքում գծային գրադիենտ մինչև 95% B, և պահպանում 95% B ևս 4 րոպե:
Հայտնաբերվում են 500-ից 5000 մ/ց զանգվածային տիրույթ ունեցող դրական իոններ։Գլյու-ֆիբրինոպեպտիդ B-ն չափվում է 45 վայրկյանը մեկ՝ զանգվածի շեղման ավտոմատ ուղղման համար:Օգտագործեք MassLynx գործիքային ծրագրակազմը MaxEnt1 ընդլայնմամբ՝ ելակետային գիծը հանելուց և հարթեցնելուց հետո միջին սպեկտրը անջատելու համար:
UMPylated HCoV-229E nsp9-ը մարսվել է՝ ավելացնելով հաջորդականության աստիճանի մոդիֆիկացված տրիպսին (Serva) և ինկուբացրել գիշերը 37 °C-ում:Chromabond C18WP պտտվող սյունակ (մաս 730522; Macherey-Nagel) օգտագործվել է պեպտիդների աղազերծման և խտացման համար:Վերջապես, պեպտիդը լուծարվեց 25 մկլ ջրի մեջ, որը պարունակում էր 5% ացետոնիտրիլ և 0,1% մածուցիկ թթու:
Նմուշները վերլուծվել են MS-ով, օգտագործելով Orbitrap Velos Pro զանգվածային սպեկտրոմետրը (Thermo Scientific):Վերջնական nanoâ HPLC համակարգը (Dionex), որը համալրված է պատվերով տեղադրված 50 սմ-ով:75 մկմ C18 RP սյունակ փաթեթավորված 2,4 մկմ մագնիսական բշտիկներով (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Միացեք զանգվածային սպեկտրոմետրին առցանց Proxeon նանոսփրեյ աղբյուրի միջոցով;ներարկեք 6 մկլ տրիփսինի մարսողության լուծույթ 300 մկմ ներքին տրամագծով ×??1 սմ C18 PepMap նախնական համակենտրոնացման սյունակ (Thermo Scientific):Որպես լուծիչ օգտագործելով ջուր/0,05% մածուցիկ թթու, նմուշը ավտոմատ կերպով փակվեց և աղազրկվեց 6 մկլ/րոպե հոսքի արագությամբ:
Ջուր/0,05% մածուցիկ թթու (լուծիչ A) և 80% ացետոնիտրիլ/0,045% մածուցիկ թթու (լուծիչ B) հետևյալ գրադիենտները օգտագործվել են տրիպտիկ պեպտիդների տարանջատմանը հասնելու համար 300 նլ/րոպե հոսքի արագությամբ. 4% B համար 5 րոպե, ապա 30 A գծային գրադիենտ մինչև 45% B րոպեների ընթացքում, և գծային աճ մինչև 95% լուծիչ B 5 րոպեի ընթացքում:Քրոմատոգրաֆիկ սյունակը միացրեք չժանգոտվող պողպատից նանոարտադրիչին (Proxeon) և ցողեք էլուենտը ուղղակիորեն զանգվածային սպեկտրոմետրի տաքացված մազանոթին, օգտագործելով 2300 Վ պոտենցիալը: Orbitrap զանգվածային անալիզատորում 60000 լուծաչափով հետազոտության սկան կապված է: առնվազն երեք տվյալների MS/MS սկանավորումներով, դինամիկ կերպով բացառված 30 վայրկյանի ընթացքում, օգտագործելով գծային իոնային թակարդի բախման առաջացրած տարանջատում կամ ավելի բարձր էներգիայի բախման դիսոցացիա՝ զուգակցված ուղեծրի հայտնաբերման հետ: Բանաձևը 7500 է:
Հրապարակման ժամանակը՝ օգ-03-2021